ХИМИЯ   БЕЛКА

а) оборудование и реактивы;

б) методы разрушения клеток: лизоцим, осмотический шок, ультразвук, Френч-пресс и др;

в) центрифугирование и ультрацентрифугирование. Осаждение белков;

г) хроматографическая очистка белков. Распределительная хроматография в жидкой фазе и в тонком слое, понятие о коэффициенте распределения, R_f. Адсорбционная хроматография (окись алюминия, силикагель, гидроксиапатит). Гидрофобная хроматография ( октил- и фенил-Сефарозы). Гель-хроматография, эффект молекулярного сита, понятие исключенного объема. Сефадекс, Сефароза, биогель, ультрагель, сефакрил и пр. Ионообменная хроматография, аниониты, катиониты. Обратнофазная хроматография;

д) афинная хроматография, принцип и возможности. Подложка (полисахарид, полиакриламид, пористое стекло), проблема минимизации неспецифической сорбции. Методы активации подложки: бромциан, периодат, эпоксиды, цианурхлорид, диазотизация. Методы введения различных функциональных групп. Проблема "руки". Получение сорбентов повышенной емкости. Количественная оценка иммобилизованного лиганда. Техника эксперимента;

е) высокоэффективная жидкостная хроматография. HPLC, FPLC. Принцип высокого разрешения ( монодисперсность и малые размеры гранул, их высокая пористость и жесткость, минимизация диффузионных процессов). Оборудование, разнообразие типов сорбентов. Гель-, ионообменная и обратнофазная хроматография;

ж) методы концентрирования белка. Осаждение сульфатом аммония, органическими растворителями (спирт, ацетон). Ультрафильтрация (Амикон). Концентриование с помощью полиэтиленгликолей, аквацида, сефадекса. Лиофилизация;

з) возможность побочных реакций при выделении белков (окисление, модификации в результате применяемых реагентов).

а) микро-Кьельдаль;

б) методы окрашивания: Лоури, нингидрин, флуорескамин, о-фталевый диальдегид. Окрашивание после осаждения белка на миллипоровый фильтр. Эффект предварительного кислотного гидролиза на чувствительность определения концентрации белка;

в) спектрофотометрические методы, минимизация вклада поглощения нуклеиновых кислот.

а) аналитическое ультрацентрифугирование;

б) электрофорез в нативных и денатурирующих условиях;

в) иммунохимические методы;

г) определение N- и С-концевых аминокислотных остатков: метод Сенджера, метод Эдмана, гидразинолиз, карбоксипептидазы.

а) зональный электрофорез, подложки (целлюлоза, крахмал, полиакриламид). Метод Леймли. Ступенчатый и градиентный электрофорез в полиакриламидном геле;

б) электрофорез в денатурирующих условиях (7М мочевина, 0,1% додецилсульфат натрия) ;

в) двумерный электрофорез, изоэлектрофокусирование, метод О’Фаррелла, иммунофорез;

г) маркеры, визуализация полос, элюция белка из геля, удаление детергентов;

д) перенос белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану (Вестернблоттинг), принцип и применение.

а) полипептидная цепь. Определение числа полипептидных цепей в белке;

б) понятие об аминокислотах, структура аминокислот. Трехбуквенная и однобуквенная системы обозначения аминокислот. Стереоизомеры. Кислотноосновные свойства, понятие и значения pK и pI. Типы боковых групп;

в) гидролиз белка: кислотный, щелочной, их особенности, преимущества и недостатки;

г) определение аминокислотного состава белка, проблема определения триптофана, цистеина, цистина. Необычные аминокислоты. Аминокислотный анализатор, современные модели, чувствительность. Переход на пикомольный уровень, флуорескамин, о-фталевый диальдегид. Газожидкостная хроматография.

а) определение N- и C-концевых аминокислотных остатков, динитрофенильный и дансильный методы. Использование амино- и карбоксипептидаз. Гидразинолиз;

б) методы фрагментации полипептидной цепи. Специфичность действия различных протеиназ: трипсин, химотрипсин, пепсин, термолизин, эластаза, субтилизин, папаин, стафилококковая протеаза. Химические методы специфического расщепления белка: по остаткам триптофана, метионина, по связям Asn-Glу, Asp-Pro, аминокислота - цистеин. Триптический гидролиз белка только по остаткам лизина или аргинина, или цистеина;

в) методы разделения и очистки пептидов. Ионообменная и гель-хроматография в жидкой фазе. Хроматография и электрофорез на бумаге и в тонком слое. Диагональный элетрофорез. Специфика выделения крупных пептидов (агрегация, плохая растворимость);

г) определение аминокислотной последовательности белка. Последовательная деградация пептидов по методу Эдмана, его модификации ("дансил-Эдман", субстратный метод). Методы идентификации ФТГ- и дансил-аминокислот;

д) автоматическое определение аминокислотной последовательности. Основные принципы работы секвенатора. Возможные источники ошибок. Брауницеровские реагенты. Твердофазный и газофазный секвенаторы. Повышение чувствительности;

е) современное состояние проблемы последовательной деградации белков и пептидов с С-конца. Карбоксипептидаза У;

ж) методы определения дисульфидных мостиков. Использование методов диагонального электрофореза и ковалентной хроматографии для выделения цистин- (и цистеин-) содержащих пептидов. Альтернативные методы определения первичной структуры: сиквенс по гену, сравнения методов.

а) классические методы, твердофазный метод, синтезатор Меррифилда. Примеры синтеза белков;

б) использование протеаз для синтеза пептидов.

а) возможности метода;

б) цели метода: получение производных при определении первичной структуры белков, топография активного центра ферментов, определение экспонированных аминокислотных остатков и детекция конформационных изменений, введение репортерных меток (радиоактивных, хромофорных, флуоресцентных, спиновых), тяжелых атомов, топография внутри- и межмолекулярных взаимодействий, иммобилизация ферментов и др.;

в) основы выбора химического агента: требование определенного уровня полноты реакции, специфичности реагента, ограничение условиями реакции (рH, температура, время), сохранность конформации и биологической активности белка, обратимость химической модификации, необходимость экспресс-анализа хода реакции и т.д.;

г) особенности и отличия реакционной способности функциональных групп белка и свободных аминокислот. Эффект конформации, ионного окружения;

д) модификация аминогруппы (с потерей заряда, с его обращением или сохранением, обратимая модификация), тиольных групп, имидазола гистидина, гидроксильных групп серина и треонина, гидроксила тирозина, аминокислотных остатков триптофана и метионина;

е) методы введения хромофорных и флуоресцентных меток (дансилхлорид, 1,8-IАЕДАNS , NВД-хлорид, тринитробензолсульфонат и др.);

з) биофункциональные реагенты, расшиваемые и нерасшиваемые. Их назначение. Иммунохимический тест "ELISA".

и) метод конкурентного мечения и его возможности. Определение рК всех аминогрупп в белке;

к) понятие о необычно реактивных функциональных группах в белках. Изучение активных центров в белке;

л) неспецифичные химические реагенты, фотоактивируемые реагенты (диазосоединения, арилазиды, арилдиазирины).

История возникновения метода. Активный центр фермента, причины высокой эффективности ферментативного катализа, образование фермент-субстратного комплекса, стерическое соответствие, принцип индуцированного соответствия фермента и субстрата. Уравнение Михаэлиса-Ментена. Понятие об обратимых и необратимых конкурентных ингибиторах.

а) типы протеаз: сериновые, тиоловые, нейтральные (Zn-содержащие);

б) активация зимогена;

в) схема активного центра, механизм функционирования, понятие об ацилферменте;

г) вклад химических методов в изучение структуры и механизма функционирования активного центра ферментов.

а) основные методы иммобилизации: ковалентное присоединение фермента к водорастворимым и водонепроницаемым подложкам, адсорбция на специфичных поверхностях, окклюдирование и капсулирование, внутри- и межмолекулярные сшивки фермента и др.;

б) понятие о стабилизации фермента как следствие его иммобилизации, ее особенности: стабилизация против микробальной и протеолитической деградации, автолиза, агрегации, денатурации, диссоциации, рH-инактивации, инактивации органическими растворителями, кислородом воздуха и среды;

в) иммобилизация клеточных органелл и целых клеток;

г) применение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, медицине и производстве.

Цели и задачи метода. Сравнение методов химической модификации, направленного и случайного мутагенеза. Примеры различных приемов мутагенеза. Требования к эффективности и точности мутагенеза.

1. Туркова Я. Афинная хроматография. М.: Мир, 1980.

2. Высокоэффективная тонкослойная хроматография. ред. А. Златкис,

Р. Кайзер М.: Мир, 1979.

3. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука, 1977.

4. Жидкостная колоночная хроматография. ред. З. Дейл, К. Мацек,

Я. Янак М.: Мир,

5. Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. М.: Химия, 1975.

6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981.

7. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983.

8. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.

М.: Наука, 1985.

9. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. ред.Э.Гросс, И.Майенхофер, М.: Мир,1983.

10. Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические носители (справочник). М.: Химия, 1972.

11. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985.

12. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот, изд. МГУ, 1985.

13. Диксон, Уэбб. Ферменты.

14. Фааль, Медьеши, Верецкий. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982.

15. "Methods in Enzуmloqy", vol. 11,25,44,45,47.

16. "Immunochemistry of Proteins", ed. M.Z.Atassi,vol. 1,2.

17. "The proteins", ed. H.Neurath, R.I.Hill,Acad. Press, 1975.

18. "Annu Rev. Biochem", vol. 42-45.

19. P.H. O'Farrell, J. Biol. Chem. 250, 4007 (1975).

20. "Technigues in Molecular Biology", ed. J.M. Walker, W. Gaastra.

21. "J.M. Gershoni, G.E. Palade, "Protein Blotting: Principles and Applications", Anal. Biochem. 131, 1-15 (1983).

22. D. Tietz, "Gel Electrophoresis of Intact Subcellular Particles", J. Chromatogr. 418, 305-344 (1987).

23. "Two-dimensional Gel Electrophoresis of Proteins. Methods and Applications", ed. J. E. Celis, R. Bravo, Acad. Press, 1984.

24. C. W. Rausch, A. H. Heckendrof, "Hiqh Performance Liguid Chromatography", in: Comprehensive Biotechnology, vol. 2, ed. C.L. Cooney, A.E. Humphrey, Pergamon Press.

25. "Handbook for HPLC for the separation of aminoacids, peptides and proteins", vol. 1-2 (1984).

26. M. T. W. Hearn, "General Strategies in the Separation of Proteins bу High-performance Liguid Chromatographic Methods", J. Chromator. 418, 3-26 (1987).

27. F.E. Regnier," Chromatography of complex protein mixtures", J.Chromator.418, 115-143 (1987).

28. "Protein Seguencing. A Praktical Approach", 1989.

29. G.E. Means, R.E. Feeny, "Chemikal Modification of Proteins", 1971.

30. J.M. Walker, "Methods in Molecular Biology", 1988.

31. N. Katunuma, "Proteinase Inhibitors", 1983.

32. "Probing Stability and Dynamics of Protein by Protease", J. Biomol. Struct.6, 1-22 (1988).

33. "Modern Methods in Protein Chemistry", 1983-1989.

34. "Protein Purification Methods (A Practical Approach)",1990.

35. "Two dimensionan electrophoresis and immunological technigues" B.S. Dunbar Plenum Press.

36. Практическая химия белка. А. Дарвре М.: Мир, 1989.

37. A. Barret, G. Salvesen eds "Proteinase inhibitors" 1988, Elseviers.

38. Степанов В.М. Структура и функция белков.

39. Protein Engineering (A Practical apprcach) IRL Prees, OXFORD, NY, Toronto A.R.Rees (ed).