Кафедра молекулярной биологии
Пущинского филиала МГУ
им. М. В. Ломоносова
ПРОГРАММА КУРСА
МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Направление: 510600 - Биология
Специализация: 51611 - Биохимия и молекулярная
биология
Составители:
доктор биологических наук, профессор
Николай Иванович Матвиенко
и доцент
Людмила Алексеевна Железная
ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА
ПРОГРАММА
- Основной метод, предпосылки и этапы развития генной инженерии.
- Методы выделения ДНК и матричных РНК из клеток. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот. Импульсный электрофорез.
- Явление модификации – рестрикции. Метилирование ДНК. Биологическая роль метилирования. Системы модификации – рестрикции I,
II, III и IV типов.
- Эндонуклеазы рестрикции II типа. Определение последовательности сайта узнавания. Метод ферментативной селекции рекомбинантных ДНК.
- Использование эндонуклеаз рестрикции типа
IIS. Модификационные профили бактериальных геномов. Защита фаговых и плазмидных ДНК от систем рестрикции.
- Клонирование генов систем модификации – рестрикции. Методы “венгерского трюка”, “троянского коня” и “
SOS отклика”. Системы mcr и mrr ограничения метилированной ДНК.
- Физическое картирование молекул ДНК. Блотинг – гибридизация нуклеиновых кислот. Редкое расщепление молекул ДНК методом “пяты Ахилла”. Пептид – нуклеиновые кислоты и их использование в методе “пяты Ахилла”.
- Методы соединения фрагментов ДНК. Свойства ДНК – лигаз и концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы. Полинуклеотид – киназа и мечение 5¢
-концов ДНК.
- Репликация ДНК
in vitro. Свойства ДНК – полимераз. Полимеразная цепная реакция.
- Физиология и генетика фага l
. Генная карта l
. Транскрипционная программа. Установление лизогенного состояния. Специфическая трансдукция. Репликационная программа. Упаковка ДНК в головку фага. Общая рекомбинация.
- Векторные мутанты l
. Spi – фенотип. Векторы внедрения и замещения. Лизогенизирующие векторы. Космиды, фагмиды, лорики.
- Плазмидные векторы. Группы несовместимости. Репликация плазмид. Плазмиды серии
pBR. Векторы для прямой селекции рекомбинантов. Плазмиды с терморегулируемой репликацией. Векторы для клонирования промоторов и терминаторов, для секреции чужеродных белков из клетки.
- Жизненный цикл нитчатого фага М13. Векторные мутанты на основе М13. Цветная идентификация рекомбинантных клонов.
- Максимализация экспрессии чужеродных генов в
E.coli .Структура промотора, регулируемые промоторы. Гибридные опероны. Слитные белки. Метод Пташне оптимизации расстояния от последовательности Шайна–Дальгарно до инициаторного кодона. Внутриклеточный протеолиз.
- Банки генов. Идентификация рекомбинантных клонов. Бинарные векторные системы. Векторы для клонирования в дрожжах (
YAC). Клонотеки генов.
- Техника “хождения” по хромосомам. Прыжковые и сцеплённые библиотеки. “Бегущие “ векторы. Геномные проекты.
- Клонирование кДНК. Обратная транскриптаза. Техника клонирования кДНК по Бергу.
- Фагово – специфичная транскрипция. Векторы для экспрессии с использованием Т7, Т3 и
SP6 РНК – полимераз. Сопряжённая транскрипция – трансляция in vitro.
- Белковая инженерия. Сайт – специфический мутагенез.
- Анализ первичной структуры ДНК и РНК.
- Регуляция активности генов антисмысловыми РНК и пептиднуклеиновыми кислотами. Определение функции гена методом “вышибания” гена из хромосомы за счёт рекомбинации с мутантным введенным геном.
ЛИТЕРАТУРА
- Маниатис Т., Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.
- Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, М.: Мир, 1988.
- Новое в клонировании ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, М.: Мир, 1989.
- Анализ генома. Под ред. К. Дейвека, М.: Мир, 1990.